bioinform magazin

  • Full Screen
  • Wide Screen
  • Narrow Screen
  • Increase font size
  • Default font size
  • Decrease font size

טיפים על קצה הטיפ גיליון 6

tipim1
בעשרים השנים האחרונות התפתחה ההנדסה הגנטית בקצב אדיר, ששום תחום אחר במדעים לא הצליח להשתוות אליו. הבסיס לפריצת דרך זו הוא ביישומן של שלוש טכניקות עיקריות: שימוש באנזימי רסטריקציה, PCR ושיטות שונות של החדרת DNA פלסמידי לתוך חיידקים. החדרת DNA פלסמידי לתוך חיידקים מאפשרת לנו לייצר את הגן שהוחדר לתוך הפלסמיד בצורה מונוקלונלית - תהליך הנקרא שיבוט (cloning) של DNA. גם אם פיסת האגרוז שבה נמצא ה-DNA שלכם נפלה על הרצפה או לתוך פח אשפה, עדיין תוכלו לשבט אותה על ידי טרנספורמציה לתוך חיידקי Escherichia coli, ולהפיק את ה-DNA שלכם בצורה נקייה במספר לא-מוגבל של עותקים.
לפניכם סדרת טיפים לטרנספורמציה מוצלחת של DNA פלסמידי לתוך חיידקים. אני מקווה שתסתייעו בהם בעבודתכם.

 

בדקו את ריכוז האנטיביוטיקה

אחת הסיבות לטרנספורמציה כושלת היא שימוש באנטיביוטיקה מסוג לא-נכון או בריכוז שגוי. כך, למשל, חיידקי E. coli XL-10Gold, הנחשבים לחיידקים הטובים ביותר למטרות שיבוט, יגדלו היטב על מצע גידול המכילµg/mlי40 של כלורמפניקול, אך אינם מסוגלים לגדול על מצע המכיל אותה אנטיביוטיקה בריכוז של µg/mlי100. הריכוזים המרביים של אנטיביוטיקה לסלקציית פלסמידים ב- E. coli הם: אמפיצילין - 100μg/mL; כלורמפניקול - 40μg/mL; קנאמצין - 50μg/mL; טטרציקלין - 12.5μg/mL. ניתן להשתמש במחצית מהריכוזים האלה.
כיצד נבדוק אם טעינו בריכוז האנטיביוטיקה או השתמשנו באנטיביוטיקה לא-נכונה? הביקורת המתאימה ביותר לפלטות גידול היא לזרוע על אותן פלטות שני סוגים של חיידקים - האחד רגיש לאנטיביוטיקה שבה אנחנו משתמשים, והאחר לא-רגיש. בד בבד, אני ממליץ על ביקורת נוספת - במקביל לטרנספורמציה של תערובת הליגציה, החדירו לאותם חיידקים קומפטנטיים את הפלסמיד הסגור (supercoiled plasmid) ששימש כווקטור שיבוט. כך, נוסף על הביקורת של פלטות הגידול, תוכלו לבדוק גם את רמת הקומפטנטיות של החיידקים שלכם. אם החדרת הפלסמיד הסגור לא הביאה לגדילה של מושבות טרנספורמנטים, או שמספרן היה קטן - הרי שאין לצפות כלל למושבות של טרנספורמנטים על פלטת השיבוט.
אם ריכוז האנטיביוטיקה בפלטות הגידול הוא תקין, אזי הסיבה לכישלון הטרנספורמציה היא רמת הקומפטנטיות של התאים, שהפכו מקומפטנטיים ל"אימפוטנטים" (ראו הטיפ "איך להפוך חיידקים לקומפטנטיים?").

 

האם התאים הקומפטנטיים הם באמת קומפטנטיים?

"קומפטנטיות" בביולוגיה מולקולרית מוגדרת כיכולת של חיידקים לקבל DNA "עירום" זר. אך האם חיידקי E. coli או Bacillus subtilis רוצים לקבל DNA זר? התשובה היא שבהחלט לא! כדי "לשכנע" אותם בכל זאת לקלוט את ה-DNA הזר, אנו מטפלים בחיידקים המסכנים בשוֹק תרמי (heat shock) או בשוֹק חשמלי (electroporation), בדומה לשיטות שהפעיל הקג"ב על אסירים פוליטיים או בדומה לשיטות המשמשות עדיין לטיפול בחולי נפש.
ב-1970 מצאו החוקרים מורטון מנדל (Mandel) ואקיקו היגה (Higa) מהוואי, כי אם מערבבים DNA של בקטריופאג λ עם חיידקי E. coli על קרח בנוכחות CaCl2, ה-DNA של הנגיף חודר לחיידקים וגורם לטרנספורמציה שלהם. יתרה מזו, הם גם גילו שאם מדגירים את תערובת ה-DNA הפאג'י עם החיידק לזמן קצר ב-42°C, כמות הטרנספורמנטים עולה במידה ניכרת. שנתיים אחר-כך השתמש סטנלי כהן (Cohen) בשיטה זו, והחדיר ל-E. coli את פלסמיד Rי (R-factor). בכך החל עידן ההנדסה הגנטית.


קומפטנטיות מוגדרת כיכולת של חיידקים לקבל DNA "עירום" זר. אך האם החיידקים רוצים לקבל DNA זר? התשובה היא שבהחלט לא!

 

ישנן ארבע שיטות עיקריות לטרנספורמציה של DNA לתוך חיידקים: טרנספורמציה כימית, טרנספורמציה חשמלית (electro-transformation or electroporation), וכן טרנספורמציה ביוליסטית (biolistic transformation) וטרנספורמציה קוֹלית (sonic transformation). שתי השיטות הראשונות, טרנספורמציה כימית וחשמלית, הן הנפוצות והמקובלות ברחבי העולם. טרנספורמציה כימית משמשת בעיקר לניסויי שיבוט או subcloning פשוטים יחסית, ואילו אלקטרופורציה משמשת בעיקר לבניית ספריות גנומיות או בשיבוטים קשים.
בטרנספורמציה כימית אנו מגדלים את החיידקים עד לאמצע הפאזה הלוגריתמית, קוצרים אותם ומטפלים בהם ביונים דו-ערכיים דוגמת Ca2+. התאים המטופלים בדרך זו מכונים קומפטנטיים. לאחר מכן מערבבים את ה-DNA הפלסמידי עם התאים הקומפטנטיים על הקרח במשך 15-30 דקות, ומעבירים אותם לאמבט 42°C למשך 45 שניות (heat shock), שבים ומקררים על קרח ואז מגדלים במשך שעה על מצע עשיר, על מנת לבטא את גן העמידות לאנטיביוטיקה (ביטוי פנוטיפי או "התאוששות"). לבסוף זורעים את התאים שהותמרו ב-DNA פלסמידי על פלטות גידול המכילות אנטיביוטיקה. בטרנספורמציה כימית, חרף השוֹק התרמי והשוֹק היוני, רק 0.3% מכלל אוכלוסיית החיידקים מסוגלים לקלוט DNA פלסמידי ולעבור טרנספורמציה. יתרה מזו, בשיטת האלקטרופורציה, כאשר חושפים את החיידקים לשוֹק חשמלי של V/cmי2,400 לפרק זמן קצר מאוד, מתים יותר מ-70% מהחיידקים. אף על פי כן, 30% החיידקים השורדים מספיקים לבניית ספריות גנומיות של 1010-109 שבטים שונים.

 

אל תוסיפו טטרציקלין בהפקות פלסמיד

חיידקי Escherichia coli XL-1Blue ו- XL-10Gold מכילים טרנספוזון 10 (Transposon 10 או Tn10) שהוחדר לתוך פלסמיד-F שלהם. טרנספוזון 10 מכיל גן עמידות לטטרציקלין, ואלפי חוקרים בוחרים להשתמש בחיידקים אלה כחיידקים קומפטנטיים לטרנספורמציה רק בשל התכונה הזאת. ואולם, חוקרים אלה מוסיפים טטרציקלין לא רק בהכנת התאים הקומפטנטיים, אלא גם בפלטות גידול ובמצעים נוזליים (starters) להפקות פלסמיד. וזה לא רעיון טוב. עמידות לאנטיביוטיקה טטרציקלין מבוססת על יצירת החלבון TetA, שהוא חלבון ממברנלי המוציא את האנטיביוטיקה מהתא (antiporter protein). הוספת טטרציקלין יחד עם האנטיביוטיקה לסלקציה של פלסמיד המטרה מקשה על החיידקים וגורמת לירידה בכמות ובאיכות של ה-DNA הפלסמידי המופק, כיוון שהחלבון TetA סותם את ממברנות החיידק ומפריע לסינתזת ה-ATP. לפיכך, הוסיפו טטרציקלין רק בשלב הכנת התאים הקומפטנטיים, ולא בסלקציה או בגידול הטרנספורמנטים.

 

בחרו בחיידק המתאים ביותר לאפליקציה שלכם

החיידק E. coli K12 הוא חיידק לא-פתוגני שבודד ב-1922 מצואתו של ילד שחלה במחלת הדיפתריה. שנים רבות שימש חיידק זה כ"חיידק דוגמה" במעבדות הסטודנטים באוניברסיטת סטנפורד. אולי משום כך נבחר החיידק לשמש כ"שפן ניסיונות" במחקרם של אדוארד טאטום (Tatum) וג'ושוע לדרברג (Lederberg), שנערך בשנות הארבעים של המאה ה-20, ואשר נבדקו בו הגנטיקה והפיזיולוגיה של E. coli באמצעות שיטות שונות של מוטגנזה. החוקרים הפעילו על החיידק המסכן כמעט כל דבר שיכול לגרום לנזק ל-DNA, כגון קרינת UV, קרינת X וחומרים מוטגניים שונים. לפיכך, כיום זוהי משימה כמעט בלתי אפשרית למצוא חיידקי E. coli K12 מזן הבר.
הודות ל-70 שנות מחקר על הגנטיקה של חיידקי E. coli K12, אנחנו יכולים היום לבחור במוטנט המתאים ביותר לאפליקציה שלנו. להלן נציג אחדות מן האפשרויות:

  • למטרות שיבוט שגרתי, השתמשו אך ורק בחיידקים שהם מוטנטים בגנים endA1, recA1 ו-hsdR. זנים של החיידקים האלה הם: XL-1Blue Top10, DH5alpha, JM109, NovaBlue ואחרים. הגן endA1 מקודד לאנדונוקליאז לא–ספציפי, שהוא חלבון פריפלסמי ועמיד לחום. מוטציה בגן זה מאפשרת לקבל DNA פלסמידי בכמות גבוהה ובאיכות טובה. אם נפיק DNA פלסמידי מהחיידק שהוא זן הבר לגבי גן זה (eendA1+) ללא טיפול בבופר מיוחד המכיל מלח קאוטרופי (chaotropic), ונוסיף אחר-כך ל-DNA פלסמידי זה אנזימי רסטריקציה ונדגיר אותם ב-37°C, אזי, במקום חיתוך באנזימי הרסטריקציה, תתרחש דגרדציה של ה-DNA על ידי EndA. אם נריץ את התוצר בג'ל אגרוז, נקבל כתם (smearing) ולא מקטעי DNA יפים. לפיכך, לא נוכל להשתמש ב-DNA ותהליך השיבוט ייכשל. מוטציה בגן recA1 מורידה את שיעור הרקומבינציה ההומולוגית בחיידק בערך פי 10,000. אנו נעזרים במוטציה זו כדי להבטיח את יציבות הגן המשובט שלנו, בעיקר אם הגן מכיל מקטעי DNA הומולוגיים ל-DNA הגנומי של החיידק או אזורים חוזרניים (direct or inverted repeats). מוטציה בגן hsdR מבטלת את פעילות הרסטריקטאז של האנזים EcoK, אך מותירה את יכולתו של אנזים זה למתל DNA (מוטציה זו מסומנת בגנוטיפ של חיידקים גם כ- rK12-mK12+g, שמשמעותהrestrictionK12- modificationK12+d). מוטנט זה הוא הכרחי לשיבוט של תוצרי PCR או DNA אחרי מוטגנזה, מפני שה-DNA באפליקציות אלה הוא לא–ממותל, ועלול להתפרק בחיידק מסוגhsdR+rK12+mK12+v.
  • לטרנספורמציה של פלסמידים גדולים מאוד, או בשיבוטים מורכבים ומסובכים, עשו שימוש בחיידק DH5alpha, הנושא מוטציה בגן deoR, או בחיידק XL-10Gold, המכיל את המוטציה Hte. deoR הוא גן רגולטורי לביטוי גנים האחראים לסינתזה של דאוקסיריבוז, שהוא כמובן מרכיב של DNA; מוטציה בגן deoR גורמת לביטוי תמידי של גנים אלה, ומאפשרת שכפול של פלסמידים גדולים. מיקומה המדויק של המוטציה Hte בגנום החיידק XL-10Gold אינו ידוע, והמוטציה קיבלה את שמה בשל הפנוטיפ של החיידק, המכונה High Transformation Efficiency. מוטציה זו מעלה במידה רבה את יעילות הטרנספורמציה של ריאקציות ליגציה או של פלסמידים גדולים כגון לנטיווירוסים (lentiviruses).
  • לשיבוט DNA שנלקח ישירות מחיידק שאינו E. coli, או מרקמות או מתאים אנימליים, השתמשו רק בחיידקים DH10B, INV110, STBL4, SURE או XL-10Gold, שחסרים בהם כמעט כל הגנים המקודדים ל"משטרת ההגירה" של חיידקי E. coli. מוטציית חסר זו רשומה בתעודת הזהות של חיידקי E. coli אלה כ-(Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr, ומשמעותה שחיידקי E. coli הללו אינם יכולים לזהות DNA זר ולחתוך אותו, או במילים אחרות, אינם יכולים להגביל את שכפול ה-DNA הזר. משום כך נקראו אנזימים אלה בשם restriction enzymes (מילולית: "אנזימי הגבלה"). מעניין לציין כי אנזים הרסטריקציה הראשון שתואר אי פעם בחיידקים הוא הרסטריקטאז של מערכת EcoKי (hsdSMR) שהזכרנו קודם, אף שאיננו משתמשים בו לצורכי שיבוט.
  • לביטוי חלבונים רקומביננטיים, עשו שימוש רק בחיידקי BL21 או בנגזרות שונות שלהם. E.coli BL21 הם חיידקים מסוג B, ולא מסוג K12, והם מוטנטים טבעיים בפרוטאז מסוג Lon. נוסף על כך, החיידקים הללו הם מוטנטים גם בפרוטאז אחר, המכונה (ompT (outer membrane protease T. מוטציות בשני פרוטאזות אלה מייצבות חלבונים רקומביננטיים ומונעות את פירוקם ב-E. coli. כמו כן, ישנם חיידקי BL21Star, המתאפיינים במוטציה נוספת בגן rne, המקודד ל-RNase E . מוטציה זו מצמצמת מאוד את פירוק ה-RNA, ובכך מעלה את זמינות ה-mRNA לעבור תרגום. לפיכך היא מאפשרת קבלת חלבון רקומביננטי בכמות גדולה יותר.

איך להפוך חיידקים לקומפטנטיים?

הכנת תאים קומפטנטיים לאלקטרופורציה היא תהליך פשוט - עליכם רק לשטוף את התאים במים פעמים אחדות. העיקר הוא שלא יישארו יונים מכל סוג שהוא סביב החיידקים, ושהחיידקים יהיו מורחפים במים נקיים.
בטרנספורמציה כימית ישנן שתי שיטות להכנת תאים קומפטנטיים: טיפול ב-CaCl2 וטיפול ב-PEG (פוליאתילן גליקול). שיטת ה-PEG היא פשוטה למדי, ודורשת רק ערבוב של החיידקים עם מצע גידול LB, המכיל 10% PEG, DMSO ויוני Mg2+. זמן ההדגרה על הקרח של ה-DNA הפלסמידי עם החיידקים אינו חשוב כלל, ואפשר אפילו לקבל מושבות של טרנספורמנטים ללא heat shock. בשיטה זו משתמשת חברת פרמנטס (Fermentas), שפיתחה את הקיט הנקרא Transform Aid Bacterial Transformation Kit. בשימוש בקיט הזה ניתן לקבל תאים קומפטנטיים מחיידקים שגדלו במצע נוזלי ב-20 דקות בלבד, ולסיים את כל תהליך השיבוט, ובכלל זה גם את שלבי הליגציה והטרנספורמציה, בתוך שעה אחת בלבד. עם זאת, אני ממליץ להשתמש בשיטה זו רק למטרות של subcloning, כלומר להכנסת פלסמידים סגורים (supercoiled or relaxed), מפני שיעילות הטרנספורמציה בשיטה זו נמוכה, ונמצאת בטווח של 106-107 טרנספורמנטים (cfu) פר מיקרוגרם של פלסמיד pUC19. יעילות טרנספורמציה זו אינה מספקת לבניית ספריות או לשיבוטים בעייתיים.
השיטה השנייה, הכנת תאים קומפטנטיים על ידי טיפול ב-CaCl2, היא הנפוצה ביותר. עד שנת 1983 השתמשו כולם רק ב-mMי50 CaCl2, עד שהתפרסם מחקרו המרשים של דגלאס הנחן (Hanahan), שבו בדק באופן שיטתי את הטרנספורמציה הכימית, ומצא כי בהוספת מתכות פוליוולנטיות כגון מנגן (Mn), רובידיום (Rb) או קובלט (Co), ניתן להגיע ליעילות טרנספורמציה של 1077-109טרנספורמנטים פר מיקרוגרם של פלסמיד pUC19.
כעבור 7 שנים, שינו Chihiro Inoue ועמיתיו את שיטתו של Hanahan על ידי גידול סטרטרים של חיידקים ב-18°C והוספת בופר PIPES. שתי השיטות הללו - של Hanahan ושל Inoue - משמשות כיום כמעט בכל מעבדה ברחבי העולם, כמו גם בחברות ביוטכנולוגיה המוכרות תאים קומפטנטיים.
חשוב לציין שתאים קומפטנטיים אינם תאי E. coli רגילים, אלא תאים עדינים מאוד, המאבדים את הקומפטנטיות שלהם במהירות רבה. התאים הקומפטנטיים רגישים לשינויי טמפרטורה וללחץ מכני. לפיכך יש להפשירם רק על קרח, כי הפשרה "ביד" גורמת לירידה של פי שניים בקומפטנטיות שלהם, והקפאה והפשרה נוספות גורמות לירידה בקומפטנטיות של עד פי עשרה. נוסף על כך, אסור לערבב תאים קומפטנטיים על ידי פיפטציה או וורטקס - הם עוברים ליזיס ונהרסים.

 

איך טרנספורמציה כימית פועלת

איש עדיין אינו יודע במדויק איך טרנספורמציה כימית פועלת. ההסבר המקובל הוא, שבמהלך הגדילה המהירה של E. coli על מצע עשיר, נוצרות בממברנה של החיידק נקבוביות רבות, המכונות אזורי אדהזיה (adhesion zones). הממברנה של חיידק מורכבת מפוספוליפידים הנושאים מטען שלילי. אף על פי שאזורי אדהזיה אלו הם גדולים מספיק כדי שה-DNA הפלסמידי יחדור פנימה, הפוספטים שבפוספוליפידים דוחים את הפוספטים שב-DNA, שאף הם טעונים מטען שלילי. פה "עולים על הבמה" כמה פקטורים חשובים. הפקטור הראשון הוא יוניCa2+, הנקשרים למטענים שליליים הן ב-DNA והן בממברנה של החיידק ומנטרלים אותם. היות שטרנספורמציה נעשית "על הקרח", הפקטור השני הוא הטמפרטורה הנמוכה, ה"מקרישה" את הממברנה הליפידית תוך ייצוב הפוספטים, ההופכים נגישים יותר לסיכוך על ידי יוני ה-Ca2+. הפקטור השלישי, והחשוב ביותר, הוא עלייה מהירה בטמפרטורה או heat shock. השוק התרמי גורם לחוסר איזון בין הטמפרטורות בצדדיה השונים של הממברנה החיידקית, ובכך גורם להיווצרות של זרם חשמלי, שיחד עם הסיכוך היוני של Ca2+, מאפשר ל-DNA הפלסמידי לעבור במהירות לתוך החיידק.
בשלב זה חשוב להקפיד על שתי נקודות: בשלב ה-heat shock, שניות ספורות מספיקות כדי לאפשר ל-DNA לחדור לתוך החיידק. לפיכך, אל תבצעו שוק תרמי של יותר מ-30 שניות. המשך המרבי של השוק התרמי הוא 45 שניות, ואם יימשך זמן רב יותר - יעילות הטרנספורמציה תפחת. כמו כן, אסור לבצע וורטקס של תערובת החיידקים עם ה-DNA הפלסמידי לפני ה-heat shock ובמהלכו. בפרוטוקול הטרנספורמציה הקלאסי כתוב לערבב את ה-DNA הפלסמידי עם תאים קומפטנטיים ולהדגיר אותם במשך 30 דקות "על הקרח" לפני השוק התרמי (אפרופו 30 דקות - ניתן לקצר את השלב הזה לדקה אחת בלבד אם הפלסמיד הוא supercoiled). במשך 30 הדקות הללו, הפלסמיד מתקרב אט-אט לחיידק, נקשר לליפופוליסכריד שלו ונשאר שם עד לשלב ה-heat shock. אם נעשה וורטקס במהלך פרק הזמן הזה, נסלק את ה-DNA ה"דבוק" לממברנת החיידק – ונפגע ביעילות הטרנספורמציה.

 

האם שלב הביטוי הפנוטיפי הוא הכרחי?

אם נשאל עשרה סטודנטים המבצעים טרנספורמציות על בסיס יומיומי, איזה פנוטיפ או תכונה של החיידק אנו מבטאים בשלב הזה, ידעו, מניסיוני, רק שלושה או ארבעה שהפנוטיפ המתבטא הוא עמידות לאנטיביוטיקה. שלב הביטוי הפנוטיפי או ה"התאוששות" נמשך שעה אחת, ולא תמיד החוקר יכול להמתין זמן כה רב. את הביטוי הפנוטיפי מבצעים על מצע עשיר (LB or SOC), ב-37°C (רצוי עם טלטול של 250rpm), וישנם עובדי מעבדה המקצרים שלב זה ל-30 דקות, אך מקטינים בכך פי שניים את יעילות הטרנספורמציה. כנגד זה, ישנן חברות המוכרות תאים קומפטנטיים, ובהן זיימו (Zymo)יRBC ואחרות, שהפרוטוקולים שלהן מנחים את המשתמש לערבב את ה-DNA הפלסמידי עם חיידקים על קרח למשך דקה או שתיים ואז לזרוע ישירות על פלטות גידול חמות, ללא שום heat shock וביטוי פנוטופי... האם שלב ה"התאוששות" הוא הכרחי, אפוא, או שאינו נחוץ כלל?


האם לקנות תאים קומפטנטיים מסחריים? השאלה היא בנאלית, אך התשובה היא רצינית מאוד: כן

 

מסתבר שהתשובה פשוטה למדי: אם הפלסמיד נושא גן עמידות לאמפיצילין, אזי ניתן בהחלט לדלג על השלב הזה. בכל מצב אחר, יש לבצע ביטוי פנוטיפי. "מצב אחר" פירושו עמידויות לכלורמפניקול, לקנאמיצין, לטטרציקלין, לסטרפטומיצין או לאנטיביוטיקה אחרת. כל סוגי האנטיביוטיקה האלו פוגעים בסינתזת החלבונים של החיידק, ובאופן פרדוקסלי, העמידויות לחומרים אלה נובעות בעצמן מחלבונים, שפעילותם האנזימטית מנטרלת אנטיביוטיקה (לדוגמה - קנאמיצין פוספוטרנספראז, כלורמפניקול אצטילטרנספראז ועוד). אמפיצילין, לעומת זאת, פוגע בסינתזת הפפטידוגליקן, ואם חיידק אינו מתחלק ואינו מסנתז דופן - אמפיצילין אינו משפיע עליו כלל וניתן לדלג על שלב ה"התאוששות" (השיטה נקראת "דקה-דקה", ובה מערבבים את ה-DNA עם חיידקים על הקרח למשך דקה, משהים ב- 42°C ל-30 שניות, מקררים על הקרח למשך דקה נוספת וזורעים ישירות על פלטות הגידול). לפיכך, בשיבוטים שאינם מבוססים על סלקציה באמפיצילין, בצעו תמיד שלב של ביטוי פנוטיפי.

 

האם לקנות תאים קומפטנטיים מסחריים?

השאלה היא בנאלית, אך התשובה היא רצינית מאוד, והיא - בהחלט כן. רמת הקומפטנטיות של תאים שהוכנו במעבדה, אפילו בשימוש בשיטה של Hanahan, היא בסביבות 108-106. לעומת זאת, ניתן להשיג תאים קומפטנטיים מסחריים שרמת הקומפטנטיות שלהם היא 109-108 מושבות של טרנספורמנטים פר מיקרוגרם של פלסמיד pUC19. למטרות שיבוט, המלצתי היא להשתמש בתאים קנויים בלבד; להעברה של פלסמידים סגורים ו"בריאים", ניתן בהחלט להשתמש בתאים "תוצרת בית". שני הגורמים הקריטיים ביותר בכל סוגי השיבוטים הם האיכות והביצוע של האנזים ליגאז ורמת הקומפטנטיות של תאי ה-E. coli (לטיפים על ריאקציית ליגציה, ראו מדור זה, BioInform 5). ההבדל בין רמת הקומפטנטיות של תאים מסחריים ותאים "תוצרת בית" הוא של פי עשרה בסך הכול, אך הבדל זה עשוי, לעתים, להיות מכריע. כך, למשל, אם ביצענו שיבוט בתאים קנויים וקיבלנו 5-9 מושבות של טרנספורמנטים, הרי שאילו השתמשנו בתאים שהוכנו במעבדה, לא היינו מקבלים דבר.
איך ניתן לחסוך בתאים הקומפטנטיים הקנויים? התשובה היא להשתמש בנפחים קטנים, ולא ב-100µl, כפי שכתוב בפרוטוקולים. ל-subcloning, המלצתי היא להשתמש ב-5-10 מיקרוליטרים של התאים בלבד, ולשיבוטים - ב-20-30µl.
קיט נחמד מאוד של חברת Zymo, הנקרא Z-Competent™ E. coli Transformation Kit, מאפשר להכין, במחיר סביר, עד 20mlי(10-20 מנות של תאים קנויים) של תאים קומפטנטיים ברמה טובה למדי, של 109-108 (cfu/µg pUC19). נוסף על שימוש בקטיונים פוליוולנטיים, קיט זה מנצל את מצע הגידול הנקרא ZymoBroth, שפותח בחברה ומשפר בהרבה את יעילות הטרנספורמציה.
לסיכום, כדי להצליח בשיבוטים בכלל ובטרנספורמציות בפרט, עלינו להביא בחשבון שני גורמים מרכזיים - הרקע הגנטי של החיידקים ורמת הקומפטנטיות שלהם.
טעות בבחירת החיידק עלולה לעלות לנו ביוקר.

זן החיידק החברה היצרנית החברה המשווקת בארץ
XL-10Gold, XL-1Blue, SURE Agilent Technologies אלדן
BL21Star, Top10,DH5alpha, DH10B, INV110, STBL4 Invitrogen רניום
JM109 Promega קיבוץ בית העמק
BL21 (plus its derivates), NovaBlue Novagen מרקורי
BL21, DH5alpha, JM109 RBC אורנת
טבלת זני החיידקים ומשווקיהם בישראל

ד"ר יבגני ברדיצ'בסקי הוא מרצה בקורס "שיטות מחקר בסיסיות בביולוגיה מולקולרית" באוניברסיטת תל-אביב. אם תרצו לשאול שאלות או להציע טיפים טובים בתחום הביולוגיה המולקולרית, אנא כתבו ל: כתובת דוא"ל זאת מוגנת מפני spambots. יש להפעיל JavaScript על מנת לראות את הכתובת

 

לקריאה נוספת:


מיקומך טיפים על קצה הטיפ
בניית אתרים